Traktowanie 5 x 10 ~ 8M 1,25 (OH) 2D3 powodowało umiarkowaną redukcję ekspresji mRNA reniny; jednakże, gdy komórki przejściowo transfekowano plazmidem pcDNA-hVDR, który zawierał pełną długość kodującą ludzki cDNA VDR, to samo traktowanie 1,25 (OH) 2D3 zmniejszało ekspresję mRNA reniny o około 90% (Figura 7, a oraz b). Zatem 1,25 (OH) 2D3 bezpośrednio tłumi ekspresję reniny w sposób zależny od VDR. Figura 7 Impresja ekspresji mRNA reniny przez 1,25 (OH) 2D3 w komórkach As4.1. (a) Komórki As4.1 przejściowo transfekowano plazmidem (+) lub bez (.) pcDNA-hVDR zawierającym cDNA ludzkiego VDR o pełnej długości, a następnie traktowano 5 x 10 <8 M 1,25 (OH) 2D3 (+ ) lub etanol (a) przez 24 godziny. Całkowity komórkowy RNA izolowano i analizowano metodą Northern blot z sondą cDNA reniny i 36B4. (b) Ilościowe wyniki analizy Northern blot uzyskane z trzech niezależnych doświadczeń. C, traktowane etanolem; VD, traktowany 1,25 (OH) 2D3; T, transfekowano pcDNA-hVDR i traktowano etanolem; T / VD, transfekowano pcDNA-hVDR i traktowano 1,25 (OH) 2D3. * P <0,001 vs. wartość C, VD lub T. (c) ekspresja mRNA reniny w komórkach As4.1 (lewy panel) oraz w komórkach As4.1 transfekowanych pcDNA-PTH / PTHrPR zawierających cDNA receptora PTH / PTHrP receptora (prawy panel) i traktowanych bydlęcym PTH (1. 34 ) jak wskazano. ., nieleczone. Aby sprawdzić, czy wysoki poziom PTH w VDR. /. myszy również przyczyniają się do podwyższenia poziomu reniny, komórki As4.1 traktowano różnymi dawkami PTH (1- 34) lub transfekowano plazmidem pcDNA-PTH / PTHrPR, który zawiera pełnej długości cDNA receptora PTH / PTHrP receptora, a następnie traktowano z PTH (1. 34). Nie zaobserwowano wzrostu ekspresji reniny w żadnej z komórek traktowanych PTH (Figura 7c). Witamina D hamuje aktywność promotora genu reniny. Wykazano, że komórki As4.1 straciły ekspresję niektórych receptorów jądrowych, takich jak LXR (4), i stwierdziliśmy, że transkrypt mRNA VDR był niewykrywalny w komórkach As4.1 metodą Northern blot (nie pokazano). W celu potwierdzenia supresji ekspresji reniny za pośrednictwem VDR, ustalono klony As4.1 trwale transfekowane wektorem pcDNA3.1 lub pcDNA-hVDR (Figura 8a). Gdy stabilne klony traktowano 1,25 (OH) 2D3, zależne od dawki tłumienie ekspresji reniny obserwowano w komórkach As4.1-hVDR, ale nie w komórkach As4.1-pcDNA (Figura 8b). Ponownie, poziom mRNA reniny zmniejszył się o około 90% w komórkach As4.1-hVDR traktowanych 10. 8 M 1,25 (OH) 2D3. Badania nad przebiegiem w czasie wykazały, że tłumienie mRNA reniny było widoczne po 6 godzinach leczenia 1,25 (OH) 2D3 (dane nie przedstawione). Aby zbadać, czy supresja z udziałem VDR występuje na poziomie transkrypcji, zmierzono aktywność promotora genu reniny w komórkach As 4.1-hVDR. Jak pokazano na Figurze 8c, transfekcja komórek plazmidem reporterowym pGL-4.1 kb zawierającym sekwencję 5 (3-kb psyliny reniny (Ren-1c) (27) skutkowała 25-krotnym wzrostem lucyferazy czynność. Traktowanie transfekowanych komórek 1,25 (OH) 2D3 zmniejszało aktywność promotora genu reniny o 4,1 kb o ponad 80%, ale nie miało wpływu na aktywność promotora SV40 w plazmidzie kontrolnym pGL3. Zatem supresja promotora genu reniny przez 1,25 (OH) 2D3 jest silna i specyficzna. Jak podano wcześniej, fragment p-flankujący o długości 117 pz miał bardzo niską aktywność (27). Wyniki te dostarczają przekonujących dowodów, że 1,25 (OH) 2D3 bezpośrednio i negatywnie reguluje transkrypcję genu reniny za pośrednictwem mechanizmu, w którym pośredniczy VDR. Figura 81,25 (OH) 2D3 tłumi transkrypcję genu reniny. (a) Ekspresja mRNA hVDR w stabilnych klonach As4.1. P, rodzicielskie komórki As4.1; 57, klon As4.1 stabilnie transfekowany pcDNA-hVDR; Klon V, As4.1 stabilnie transfekowany pustym wektorem pcDNA3.1. (b) ekspresja mRNA reniny w klonie V V4 (wektor) As4.1 i 57 potraktowanym etanolem (E) lub różnymi dawkami 1,25 (OH) 2D3, jak wskazano. (c) Komórki As4.1-hVDR (klon 57) transfekowano plazmidem reporterowym lucyferazy pGL3, pGL-4.1 kb lub pGL-117bp, a następnie traktowano etanolem (czarne słupki) lub 10. 8 M 1,25 ( OH) 2D3 (białe słupki). Aktywność lucyferazy określono 48 godzin po transfekcji. Podobne wyniki uzyskano w innych stabilnych klonach (dane nie przedstawione). Omówienie Główną fizjologiczną funkcją układu renina-angiotensyna jest utrzymanie oporu naczyniowego i homeostazy objętości komórek pozakomórkowych. Osiąga się to głównie dzięki działaniom regulacyjnym Ang II na obwodowe unaczynienie, serce, CNS, nerki i nadnercza. Jako składnik ograniczający szybkość kaskady renina-angiotensyna, wydzielanie i wytwarzanie reniny jest w większości stymulowane przez zmniejszenie objętości lub soli, zmniejszenie ciśnienia perfuzji naczyniowej nerki i aktywność nerwów współczulnych (1, 2). [hasła pokrewne: szpital jurasza rejestracja, trening funkcjonalny książka, jak dobrać narty dla dziecka ] [hasła pokrewne: dieta dla cukrzyków typu 2 jadłospis, trening funkcjonalny książka, przelicznik spalania kalorii ]
