Po inkubacji ze skoniugowanym z peroksydazą anty-króliczym IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, Maryland, USA), sygnał reniny wizualizowano za pomocą zestawu substratu peroksydazy DAB (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA), a następnie barwienie kontrastowe hematoksyliną. Izolacja RNA i Northern blot. Nerkę i wątrobę wycięto i natychmiast umieszczono w odczynniku Trizol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) w celu całkowitego wyizolowania RNA zgodnie z instrukcją producenta. Aby określić ekspresję mRNA dla reniny lub angiotensynogenu, całkowite RNA (20 .g / ścieżkę) rozdzielono na 1,2% żelu agarozowym zawierającym 0,6 M formaldehyd, przeniesiono na nylonową membranę transferową (Micron Separations Inc., Westborough, Massachusetts, USA), i sieciowany w ultrafioletowym łączniku krzyżowym (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Hybrydyzację przeprowadzono jak opisano wcześniej (25). Sondy cDNA mysiej reniny i angiotensynogenu znakowano 32P-dATP (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, Kalifornia, USA) przy użyciu systemu znakowania Prime-a-Gene (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Po hybrydyzacji i przemyciu membrany eksponowano na promieniowanie rentgenowskie w temperaturze -80 ° C w celu autoradiografii. Względną ilość mRNA określono ilościowo przy użyciu PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA) i znormalizowano za pomocą mRNA 36B4, jak opisano poprzednio (25). Kultura komórkowa As4.1 i transfekcja. Komórki As4.1 (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS w 37 ° C i 5% CO2. W celu przejściowej transfekcji komórki hodowano w naczyniach o średnicy 10 cm do 50% konfluencji i transfekowano plazmidem pcDNA3.1, pcDNA-hVDR lub pcDNA-PTH / PTHrPR (10 .g DNA na szalkę) standardową metodą fosforanu wapnia. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji komórki traktowano przez 24 godziny 5 x 10 ~ 8 M 1,25 (OH) 2D3 lub etanolem w pożywce bez surowicy lub z różnymi dawkami bydlęcego PTH (1. 34), jak wskazano. . Całkowity RNA wyizolowano i analizowano pod kątem ekspresji mRNA reniny metodą Northern blot. W celu stabilnej transfekcji komórki As4.1 transfekowano plazmidem pcDNA3.1 lub pcDNA-hVDR za pomocą odczynnika SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, Kalifornia, USA) i wybrano za pomocą 350 .g / ml G418 przez 2 tygodnie. Poszczególne kolonie zostały wybrane, rozwinięte i wybrane do ekspresji VDR. Stabilne klony As4.1-hVDR traktowano różnymi dawkami 1,25 (OH) 2D3 przez 24 godziny w pożywce bez surowicy, a całkowity RNA analizowano metodą Northern blot w celu zbadania ekspresji reniny. Analiza promotora genu Renin. Plazmid pR1C-4.1CAT, który zawierał 4,1 kb 5f-flankującą sekwencję mysiego genu Ren-1c (27) dostarczali KW Gross (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York, USA). Aby wytworzyć plazmid reporterowy pGL-117bp, fragment promotora reniny minimalnej 123-bp (+6 do. 117) uwolniono z pR1C-4.1CAT z Xbal i BamHI i wstawiono do miejsca Hindlll wektora podstawowego pGL3 (Promega Corp.) . W celu wygenerowania plazmidu reporterowego pGL-4.1 kb, fragment BamHI ((4,1 kb do około 118 pz) z pR1C-4.1CAT wstawiono do miejsca Bglll pGL-117bp. W celu analizy aktywności promotora genu reniny, komórki As4.1-hVDR transfekowano plazmidami reporterowymi przez elektroporację zgodnie z metodą Shi i in. (5) przy użyciu Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories Inc.). plazmid pCMV. – galaktozydazę (a-gal) kotransfekowano jako kontrolę wewnętrzną. Jako kontrolę pozytywną zastosowano plazmid kontrolny pGL3 (Promega Corp.). Transfekowane komórki traktowano etanolem lub 10 (8 M 1,25 (OH) 2D3 w podłożu Opti-MEM (Invitrogen Life Technologies) zawierającym 2% FBS traktowanym węglem aktywnym w 4 godziny po elektroporacji, a aktywność lucyferazy oznaczano 48 godzin po początkowa transfekcja z zastosowaniem systemu do oznaczania lucyferazy (Promega Corp.). Aktywność lucyferazy normalizowano względem aktywności p-galu uzyskanej z tej samej elektroporacji i prezentowano jako indukcję krotności opartą na podstawowej aktywności pustego wektora podstawowego pGL3 określonego w tym samym eksperymencie. Analiza statystyczna. Dane przedstawiono jako średnie. SD i analizowano za pomocą testu ucznia w celu oceny istotności. Wartości P równe 0,05 lub niższe uznano za statystycznie istotne. Wyniki Ekspresja reniny i wytwarzanie plazmy Ang II są podwyższone u myszy pozbawionych VDR. Aby przetestować naszą hipotezę, najpierw poddaliśmy analizie VDR. /. myszy. Uznaliśmy, że jeśli hipoteza jest prawidłowa, ekspresja reniny powinna być zwiększona u zmutowanych myszy z powodu zakłócenia szlaku sygnałowego witaminy D. Przez analizę ilościową Northern blot stwierdziliśmy, że poziom mRNA reniny w nerkach dorosłych VDR. /. myszy były ponad trzykrotnie wyższe niż myszy z miotu typu dzikiego (ryc. 1, aib)
[więcej w: marcin mentel, krzew koki, peru bezpieczeństwo ]
[przypisy: szpital jurasza rejestracja, krzew koki, operuje w peru ]
