Aby przypisać znaczenie funkcjonalne dla indukowanej przez LIF ekspresji c-fos i JunB mRNA oraz dla addytywnego wpływu zarówno LIF, jak i CRH na ich transkrypcję, badaliśmy, czy w podobny sposób jak CRH (13, 14), LIF może również stymuluje aktywność wiązania AP-1 do dobrze opisanego elementu AP-1 na eksonie promotora POMC. Wyciągi jądrowe pochodzące z komórek stymulowanych przez godzinę LIF, CRH lub LIF + CRH zastosowano w EMSA z sondą znakowaną 32P zawierającą miejsce POMC AP-1 (Figura 6a). Utworzenie specyficznego kompleksu AP-1, który był całkowicie konkurowany ze 100-krotnym nadmiarem molowym zimnego oligonukleotydu AP-1 (self), ale nie przez zmutowany oligonukleotyd AP-1 (mut), indukowano zarówno przez LIF, jak i CRH, i dodatkowo stymulowane przez połączone traktowanie LIF + CRH. Wykazano, że zarówno c-fos, jak i JunB są składnikami tego indukowalnego przez LIF i CRH kompleksu, ponieważ jego powstawanie zostało zredukowane po wcześniejszym wzejściu przeciwciał anty-c-fos lub anty-JunB do ekstraktów jądrowych traktowanych LIF + CRHa. Skromne resztkowe wiązanie, które prawdopodobnie odzwierciedla indukowaną przez CRH aktywność wiązania CREB (12), było nadal obserwowane, gdy dodano oba przeciwciała anty-c-fos i anty-JunB. Ten wynik wskazuje, że wywołane LIF wiązanie c-fos / JunB do miejsca AP-1 promotora POMC może być zaangażowane w działanie kortykotropowe LIF, oprócz uprzednio zidentyfikowanego miejsca wiążącego DNA STAT3 na promotorze POMC. W konsekwencji usunęliśmy region promotora POMC + 34 / +53 (konstrukt J) lub zmutowano to miejsce AP-1 na promotorze POMC (konstrukt K), i wykorzystaliśmy te konstrukty do kierowania ekspresją genu lucyferazy w przejściowo transfekowanych komórkach AtT20 (fig. 6b). Delecja lub mutacja miejsca wiążącego POMC egzon-1 AP-1 znacząco (P <0,001) zmieniła aktywność promotora POMC LIF-LIF + i LIF + CRHa (odpowiednio 83 . 1% i 74 . 4% dla LIF; 0,4% i 80 ~ 4%, odpowiednio dla LIF + CRH) w porównaniu z konstruktem pełnej długości typu dzikiego (Figura 6b), który potwierdził funkcjonalne zaangażowanie tego elementu wiążącego w pośredniczeniu w indukcji LIF i CRH aktywności promotora POMC. Figura 6LIF i CRH mają addytywny wpływ na wiązanie c-fos i JunB z elementem POMC ekson-1 AP-1. (a) Jako sondy zastosowano wyznakowany 32P dwuniciowy oligonukleotyd odpowiadający regionowi + 33 / + 54 AP-1 promotora POMC (5a - + 33AGGAGCAGTGACTAAGAGAGGC + 54-3). Komórki były nietraktowane lub traktowane przez godzinę z nM LIF i / lub 10 nM CRH. Stosując 15 | jg ekstraktów jądrowych z 1-godzinnego traktowanego LIF + CRHa komórek AtT20, przeprowadzono współzawodnictwo ze 100-krotnym nadmiarem molowym zimnego + 33 / + 54 dwuniciowego oligonukleotydu AP-1 (auto), zmutowanego AP-1 dwuniciowy oligonukleotyd (mut) (5a - + 33AGGAGCAGCGTACGAGAGAGC + 54-3-a), z .g przeciwciała anty-c-fos (c-fos Ab), z .g przeciwciała anty-JunB (JunB Ab) lub .g anty-c-fos i .g przeciwciała anty-JunB (c-fos + JunB Ab). (b) promotor POMC usunięty z + 34 / +53 (konstrukt J) lub zmutowany w regionie + 41 / + 47 (konstrukt K) (5 (3 - + 41CGTACGA + 47-3) połączono z genem reporterowym lucyferazy i przejściowo transfekowane w komórkach AtT20 (9). Komórki stymulowano nM LIF lub nM LIF + 10 nM CRH przez 6 godzin. Aktywność lucyferazy mierzono w lizatach komórkowych w obecności substratu lucyferynowego. Wyniki wyrażono jako procent kontroli (n <3; kontrola = 100% = pełnej długości. 706 / + 64 promotor POMC). AP <0,01 dla usuniętych lub zmutowanych konstruktów promotora POMC (konstrukty J i K) względem pełnej długości promotora POMC (czarny słupek). NT, kontrola traktowana nośnikiem. W indukowanej LIF c-fos i transkrypcji JunB pośredniczy STAT3. Ponieważ wykazano, że szlak JAK2-STAT3 jest kluczowy dla funkcji LIF kortykotropowej (18), a promotory c-fos i JunB zawierają również miejsca wiążące STAT3 (28, 29), badaliśmy, czy indukowana LIF c-fos i transkrypcja JunB był zależny od STAT3 (rysunek 7). W istocie, zakłócenie indukowanej przez LIF aktywacji STAT3 w komórkach nadeksprymujących SOCS-3 spowodowało uchylenie wywołanej LIF, ale nie wywołanej CRH, ekspresji mRNA c-fos i JunB, podczas gdy efekty LIF w komórkach pozornie transfekowanych były podobne do tych w obserwowane w nietransfekowanych komórkach typu dzikiego (figura 7). Figura 7 Blokada STAT3 indukowanego LIF w nadeksprymującym SOCS-3 (3 komórkach AtT20 znosi stymulację LIF dla transkrypcji c-fos i JunB. Łącznie 10 .g całkowitego RNA wyekstrahowanego z nM LIFa, 10 nM CRHa lub LIF + CRHa traktowanych pozornie lub transfekowanych SOCS-3 (3 komórek AtT20 przez 30 minut lub godzinę rozdzielono na 1% agarozy / formaldehydu. żel i przeniesione na membranę nitrocelulozową. Przeprowadzono hybrydyzację z wyznakowaną 32P dwuniciową sondą DNA odpowiadającą sekwencji kodującej c-fos, JunB lub (3-aktyny, jak opisano poprzednio (23). [hasła pokrewne: jak dobrać narty dla dziecka, sennik wygrana na loterii, rezonans magnetyczny cena warszawa ] [podobne: operuje w peru, kokaina produkcja, peru bezpieczeństwo ]
