Potencjał terapeutyczny IL-4 został również zbadany w zwierzęcych modelach zapalenia stawów, w szczególności wywołanego kolagenem zapaleniu stawów (CIA). CIA jest hamowana przez IL-4 podawaną w sposób ciągły przez wszczepione pompy (18) lub przez leczenie komórkami jajnika chomika chińskiego wytwarzającego IL-4 (19). Ostatnio doniesiono, że nadekspresja IL-4 w adenowirusowych wektorach w stawach kolanowych myszy z CIA zapobiegała zniszczeniu chrząstki i erozji kości (22, 23). W RA wstępne badania fazy I zaczęły wykorzystywać systemowe podawanie IL-4 przez wielokrotne wstrzyknięcie. W niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ DC pochodzących z szpiku kostnego genetycznie zmodyfikowanych w celu ekspresji IL-4 na CIA u myszy. Stwierdziliśmy, że pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe niewielkiej liczby DC poddanych transdukcji IL-4P znacząco zmienia przebieg zapalenia stawów. Efekty funkcjonalne dobrze korelowały ze skutecznością różnicową migracji DC z różnych miejsc wstrzyknięcia do śledziony. Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwszy raport oceniający immunoterapię z zastosowaniem retrowirusowych stransdukowanych DC dla choroby autoimmunologicznej. Metody Myszy. Męskie myszy DBA / LacJ, w wieku 7. 8 tygodni, zakupiono w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA). Myszy utrzymywano w Oddziale do Laboratoryjnej Medycyny Zwierzęcej Uniwersytetu Michigan. Procedury dotyczące stosowania zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania i opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Michigan. Pożywka do hodowli. Kompletna pożywka (CM) składała się z RPMI 1640 uzupełnionej 10% dezaktywowaną termicznie FCS, 0,1 mM aminokwasów nieistotnych, 1. M pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 100 U / ml penicyliny, 100. G / ml streptomycyny, i 5 x 10 5 M 2-ME (wszystkie z Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA). Pożywka dla limfocytów (LM) składała się z pożywki Click. S (Life Technologies Inc.) uzupełnionej 1% inaktywowaną termicznie surowicą mysią, penicyliną, streptomycyną i 2-ME. LM zastosowano do hodowli komórek śledziony lub komórek węzłów chłonnych od myszy, które otrzymały iniekcje DC, w celu uniknięcia odpowiedzi na składniki FCS. Konstrukcja wektora retrowirusowego. W niniejszym badaniu zastosowano retrowirusowy konstrukt wektorowy (pRET6), który zawiera długie końcowe powtórzenia pochodzące z mieloproliferacyjnego wirusa mięsaka, jak również gen oporności na puromycynę. cDNA kodujący mysią IL-4 uzyskano z pNGVL3-mIL-4 (Vector Core, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA). W celu skonstruowania wektora retrowirusowego mIL-4 (pRET6-IL-4) fragment mIL-4 o długości 443 bp wycięto EcoRV i Not I z pNGVL3-mIL-4 i subklonowano do wektora pBluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, USA). Fragment Xho I i Not I z pBluescript-mIL-4 następnie subklonowano do pRET6. Podobnie, cDNA kodujący wzmocnione białko o zielonej fluorescencji (EGFP, otrzymany z pEGFP-1, CLONTECH, Palo Alto, Kalifornia, USA) subklonowano do pRET6, aby utworzyć pRET6-EGFP. Amfotropiczna linia komórek pakujących Phoenix (A NXA dostarczona przez G. Nolana, Stanford University, Palo Alto, Kalifornia, USA) została przejściowo transfekowana konstruktem pRET6-mIL-4 lub pRET6-EGFP przy użyciu precypitacji wapniowo-fosforanowej. Ekotropową linię komórek pakujących GP + E86 (24) infekowano następnie filtrowanymi wirusowymi supernatantami z ANXA w obecności protaminy. Po selekcji puromycyną (4 .g / ml) te poliklonalne komórki GP + E86 zastosowano jako linie komórkowe producenta. Generowanie retrowirusowo transdukowanych DC z komórek szpiku kostnego. Szpik kostny został wypłukany z kości udowych i piszczeli oraz pozbawiony erytrocytów przez lizę w buforze hipotonicznym. Komórki szpiku kostnego (106 / ml) wysiano na 9,5 x 106 napromienionych (30 Gy) komórek produkujących w kolbach hodowlanych o objętości 150 cm2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA). Komórki hodowano przez 2 dni w 37 ° C, 5% CO2 w obecności 10 ng / ml rekombinowanego mysiego GM-CSF (rmGM-CSF, Immunex Corp., Seattle, Washington, USA), 10 ng / ml rekombinowanego mysiego IL -4 (rmIL-4; Schering-Plough, Kenilworth, New Jersey, USA) i 8 (ig / ml siarczanu protaminy w CM. W celu wytworzenia kontrolnych DC (pozornie transdukowanych DC), komórki szpiku kostnego hodowano wspólnie z nietransdukowanymi liniami komórkowymi GP + E86. W dniu 2, nieprzylegające komórki ostrożnie usunięto z adherentnych linii komórkowych producenta i powtórzono przy 106 / ml w CM za pomocą rmGM-CSF i rmIL-4. W dniu 5 zebrano niepadherentne komórki i DC wzbogacono przez odwirowanie z gradientami 14,5% metrizamidu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) (25). DC były płukane w HBSS przed iniekcją. Fenotyp powierzchni komórki. DC analizowano przez bezpośrednie lub pośrednie barwienie mAb na markerach powierzchni komórki. Komórki wstępnie inkubowano z 2,4 G2, szczurzym mAb anty-Fc receptora i inkubowano z mAb sprzężonymi z PE przeciw CD11c, CD40, CD80 lub CD86 (wszystkie z BD PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA)
[hasła pokrewne: operuje w peru, peru bezpieczeństwo, sennik wygrana na loterii ]
[patrz też: choroba hashimoto u dzieci, lekarz medycyny pracy opole, toaleta drzewa oskrzelowego ]
