W różnych punktach czasowych po operacji pozorowanej lub CLP izolowano tymocyty, barwiono za pomocą Ax-FITC i PI i analizowano na cytometrze przepływowym. Cztery grupy komórek różnicowano według wzorów barwienia: normalne komórki (Axa PI.), Wczesne stadia komórek apoptotycznych (Ax + PIa), późne komórki apoptotyczne i wczesne komórki nekrotyczne (Ax + PI +) i komórki martwicze ( Ax. PI +) (Figura 2a). Stwierdzono zasadniczą apoptozę we wczesnym stadium z odsetkiem 3. 5% w całej populacji tymocytów (czas 0, Figura 2b). Operacja pozorowana spowodowała niewielką ilość wczesnego stadium apoptozy (<10%). Jednak odsetek wczesnych komórek apoptotycznych zaczął wzrastać 6 godzin po wystąpieniu posocznicy, osiągając około 30% po 12 i 24 godzinach, a następnie zmniejszając się do około 15% po 48 godzinach (Figura 2b). CLP indukował również postępujący wzrost odsetka późnych apoptotycznych i wczesnych nekrotycznych tymocytów, ale operacja pozorowana nie była (Figura 2c). Figura 2Flow cytometryczną analizę barwienia Axe (FITCa) i PI (PIa) w tymocytach ze szczurów pozorowanych lub CLP. Tymocyty izolowane od pozorowanych lub CLP szczurów we wskazanych czasach wybarwiano Ax-FITC i PI. (a) Analiza FACS apoptotycznych tymocytów szczurów zdrowych, pozorowanych i CLP 24 godziny po operacji. Regiony tylko dla Ax-positive (Ax + PI ., dolny prawy), tylko PI-pozytywny (Ax. PI +, lewy górny), podwójnie dodatni (Ax + PI +, prawy górny) i podwójnie ujemny (Ax. PI a, dolny lewy) zostały ustalone jak opisano w Metodach. (b) Procent wczesnych stadiów apoptozy tymocytów w ciągu 48 godzin po pozorowanej lub wywołanej CLP posocznicy. (c) Procent późnych apoptotycznych i wczesnych nekrotycznych tymocytów w ciągu 48 godzin po pozorowanej lub wywołanej CLP posocznicy. AP <0,05 w porównaniu z grupą pozorów. BP <0,01 w porównaniu z grupą pozorowaną. Wartości reprezentują środki. SEM (n = 3 lub 4 zwierzęta). Zmniejszenie utraty grasicy i apoptozy tymocytów w sepsie po zablokowaniu C5a. Wykazano gwałtowny spadek masy grasicy po wystąpieniu posocznicy (ryc. 3). Znaczna utrata masy ciała wystąpiła już po 12 godzinach od operacji CLP (P <0,05). Ciężar grasicy osiągnął najniższy poziom (50%) w ciągu 24 godzin (P <0,01). Nie stwierdzono dalszej utraty masy ciała po 48 godzinach. Blokada C5a radykalnie zmniejszyła utratę masy grasicy wywołaną przez CLP w ciągu 48 godzin. U szczurów CLP leczonych anty-C5a grasica nie zmieniła się znacząco w ciągu 24 godzin (Figura 3). Grubość grasicy nieznacznie spadła po 48 godzinach w grupie leczonej anty-C5a, ale była znacznie wyższa niż w grupie CLP (P <0,01). Rycina 3 Wpływ blokady C5a na atrofię grasicy wywołaną przez CLP. Bezpośrednio po operacji CLP zwierzętom podawano dożylnie 400 .g preimmunizacyjnej IgG lub 400 .g anty-szczurzej C5a IgG (A C5a). We wskazanych punktach czasowych zwierzęta uśmiercono i ważono grasicę. Ten sam protokół blokady C5a zastosowano we wszystkich kolejnych figurach. Dla każdego pionowego paska, n = 4 lub 5 zwierząt. AP <0,05 w porównaniu z kontrolą IgG. BP <0,01 w porównaniu do kontroli IgG. Wpływ blokowania C5a na apoptozę określony przez fragmentację DNA oceniano 24 godziny po rozpoczęciu sepsy. Wywołane CLP fragmentowanie DNA zostało zredukowane poniżej wykrywalnych poziomów po zablokowaniu C5a (Figura 4a). Odpowiednio, traktowanie anty-C5a spowodowało znaczące zmniejszenie indukowanych CLP komórek apoptotycznych we wczesnym stadium o 80% (P <0,01) (Figura 4, b i c), podczas gdy późne apoptotyczne i wczesne martwicze komórki zmniejszyły się o 93% (P <0,05). 0,05) u zwierząt CLP leczonych anty-C5a (Figura 4d). Figura 4 Zabezpieczenie tymocytów przed apoptozą przez blokowanie C5a w posocznicy wywołanej CLP. Dwadzieścia cztery godziny po operacji, tymocyty zebrano z kontrolnych, pozorowanych, traktowanych CLP z przed immunizacją IgG i szczurów CLP traktowanych C5 i oceniano pod kątem fragmentacji DNA i barwienia Ax / PI przy użyciu tych samych protokołów opisanych dla Figur 1. i 2. (a) Wpływ blokady C5a na fragmentację DNA indukowaną przez CLP, reprezentatywną dla trzech oddzielnych doświadczeń. (b) Ilościowa analiza wpływu blokady C5a na apoptozę tymocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Procenty komórek apoptotycznych we wczesnym stadium (c) i późnych apoptotycznych / wczesnych komórek nekrotycznych (d) przedstawiono jako średnie. SEM (n = 4 zwierzęta). Hamujące działanie blokady C5a na aktywację kaspazy i uwalnianie cytochromu c z mitochondriów tymocytów podczas sepsy. Na podstawie przebiegu apoptozy tymocytów w posocznicy (ryc. 2b) wykorzystano punkt czasowy 12 godzin do oceny aktywacji kaspazy i translokacji cytochromu c od mitochondriów do cytozolu. W porównaniu do kontroli pozorowanych aktywność kaspazy-3 w tymocytach zwiększyła się trzykrotnie, a aktywność kaspazy-6 i kaspazy-9 wzrosła dwukrotnie w ciągu 12 godzin po CLP [patrz też: dzień dziecka utraconego, jaki materac dla niemowlaka, peru ciekawostki ] [hasła pokrewne: publiczny bank krwi pępowinowej, jak dobrać narty dla dziecka, jaki materac dla niemowlaka ]
